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【Ln-MOF】生物反应兼容双变量镧系MOF传感器实现ctDNA现场检测的刺激多响应平台
摘要：
武汉大学肖玉秀老师等报道的本篇文章（Anal. Chem. 2024）中指出在液体活检中检测循环肿瘤DNA (ctDNA)对于肿瘤诊断至关重要，但由于ctDNA在体液中含量低，检测工作具有一定难度。本研究建立了一种新的ctDNA检测平台，该平台利用新设计的双变量镧系金属-有机框架(LnMOF)，即Ce/Eu-DPA MOF (CE-24, DPA = 2,6-吡啶二甲酸)，通过量化DNA扩增副产物焦磷酸盐(PPi)来实现。CE-24 MOF通过主客体相互作用对PPi刺激表现出超快的双重响应（荧光增强和酶活性抑制）。该平台结合等温核酸指数扩增反应(EXPAR)，用于检测与结直肠癌相关的ctDNA (KRAS G12D突变)。ctDNA触发产生大量PPi，通过PPi的比率荧光/比色双模式检测实现ctDNA的定量。EXPAR和双模式PPi传感的结合，使ctDNA检测方法具有低成本、便捷性、生物反应兼容性（不受生物反应系统干扰）、高灵敏度（检测限低至10^-15 M），并适用于现场检测。据我们所知，这项工作是首次将Ln-MOF应用于ctDNA检测，为临床快速检测核酸生物标志物提供了一种新的通用策略。
研究背景：
1. 在肿瘤诊断领域，ctDNA的检测因含量低和正常细胞核酸片段背景高而面临挑战，现有的检测技术依赖于高精密度仪器和专业技术人员，限制了临床应用的可行性。
2. 已有的检测技术包括液滴数字聚合酶链反应、靶向深度测序等，但这些方法需要复杂的设备和操作。
3. 本研究的作者创新性地设计了一种基于双变量LnMOF的ctDNA检测平台，该平台通过检测DNA扩增过程中产生的PPi来实现对ctDNA的高灵敏度检测，并通过EXPAR技术简化了检测过程。
实验部分：
1. Ce/Eu-DPA MOFs的合成：
- 采用溶剂热法合成了六种不同比例的Ce/Eu-DPA MOFs，具体化学式为CE-60, CE-51, CE-42, CE-24, CE-15, 和 CE-06。
- 使用ICP-OES分析确认了MOFs中Ce和Eu元素的掺杂情况，确保了元素的成功掺入。
2. 物理化学性质的表征：
- TEM结果显示CE-24 MOF呈现100-200 nm的不规则片状结构。
- FT-IR分析显示DPA配体的羰基伸缩振动吸收峰从1697 cm⁻¹移至1603 cm⁻¹，表明了DPA与Ce³⁺和Eu³⁺的配位。
- XPS分析确认了MOF中Eu, Ce, C, O, N元素的存在，并通过高分辨谱图分析了Eu 3d和Ce 3d的价态。
3. 催化活性和底物选择性的研究：
- 在弱碱性条件下，使用CE-24 MOF对四种显色底物（TMB, o-PD, DA, L-DOPA）进行催化氧化实验，通过测量在400, 468, 414, 和 362 nm处的最大吸收，确定了L-DOPA为最佳底物。
4. PPi刺激下的荧光增强和催化活性抑制实验：
- 实验中发现PPi能够显著增强CE-24 MOF在616 nm处的荧光强度（Eu³⁺），而395 nm处的荧光强度（Ce³⁺）几乎不变，表明Ce³⁺可作为荧光内标。
- PPi的加入显著抑制了CE-24 MOF催化L-DOPA氧化的能力。
5. ctDNA检测的EXPAR实验：
- 设计了针对KRAS G12D突变的ctDNA的EXPAR方案，利用CE-24 MOF对PPi的响应实现了ctDNA的定量检测。
- 实验结果显示，ctDNA的检测限可达到101 fM，远低于商用染料calcein的检测限。
6. 反应条件的优化：
- 优化了EXPAR反应中的dNTPs浓度、Nt.BstNBI和Bst 2.0 DNA聚合酶的用量以及孵化时间，以提高检测的灵敏度和准确性。
7. 特异性和抗干扰能力测试：
- 通过向反应体系中添加可能存在于EXPAR系统中的干扰物（如dNTPs, 腺苷酸，腺苷二磷酸，K⁺, Cl⁻, Mg²⁺, NH₄⁺, 和SO₄²⁻），验证了PPi检测的特异性和抗干扰能力。
分析测试：
1. ICP-OES分析：
-确定MOFs中Ce和Eu的掺杂量。
2. TEM分析：
- CE-24 MOF的尺寸为100-200 nm，形态为不规则片状。
3. FT-IR分析：
- DPA配体的羰基伸缩振动吸收峰移动至1603 cm⁻¹。
4. XPS分析：
- Eu 3d的特征峰位于1134.38 eV，Ce 3d的特征峰分别位于911.21, 905.74, 902.83, 900.35, 886.26, 和 881.78 eV（Ce (IV)）以及904.07 和 884.65 eV（Ce (III)）。
5. 荧光光谱分析：
- 在PPi刺激下，CE-24 MOF在616 nm处的荧光强度增强，而395 nm处的荧光强度几乎不变。
6. 比色检测：
- L-DOPA的氧化导致颜色变化，通过测量468 nm处的吸收强度来检测PPi。
7. 理论计算：
- 使用DFT计算了PPi与MOF之间的相互作用，PPi分子的吸附能为-118.44 kcal/mol。
8. 吸附能量和表面电荷分析：
- PPi的加入导致CE-24 MOF表面电荷改变，分子尺寸远小于MOF孔径，表明PPi可以吸附到MOF表面并进入其内部。
9. 孔径和比表面积分析：
- PPi添加后，CE-24 MOF的孔径从10.94 nm扩大到13.48 nm。
10. 荧光寿命衰减分析：
- CE-24 MOF的荧光寿命从1.151 ms增加到1.539 ms，表明PPi的加入提高了MOF的荧光效率。
11. 电子转移机制研究：
- PPi的LUMO高于DPA和Eu³⁺的激发态，促进了从PPi到MOF的电子转移，触发了荧光“开启”。
12. ctDNA检测性能评估：
- 在优化条件下，ctDNA的检测限为101 fM，通过荧光/比色双模式检测，具有高灵敏度和特异性。
总结：
本文通过构建基于Ce/Eu-DPA MOF (CE-24)的双变量传感器，实现了对ctDNA的超灵敏检测。利用EXPAR技术放大ctDNA产生的PPi信号，结合CE-24 MOF的荧光增强和酶活性抑制的双重响应，实现了对ctDNA的低成本、高灵敏度、现场适用的检测。该方法的检测限达到10^-15 M，远低于市面上的荧光指示剂calcein，且具有较宽的检测窗口和良好的抗干扰能力。
展望：
1. 本文提出了一种高灵敏度的ctDNA检测方法，但对于实际临床样本的复杂性考虑可能不足，未来研究应进一步验证该方法在复杂生物样本中的适用性。
2. 本文展示了MOFs的多功能性，未来可深入探讨MOFs的长期稳定性和可能的生物安全性。
3. 进一步研究MOFs在不同存储和使用条件下的稳定性，并评估其在生物体内的安全性，为临床应用提供更多数据支持。同时，探索该平台对于其他类型核酸标记物的检测能力，拓宽其应用范围。
Bioreaction-Compatible Bivariate Lanthanide MOF Sensor Enables Stimulus-Multiresponsive Platform for ctDNA On-Site Detection
文章作者：Yumin Feng, Long Yu, Qi Xu, Zhongyu Wei, Zhiwen Gan, Xilin Nie*, and Yuxiu Xiao*
DOI：10.1021/acs.analchem.4c01207
文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.4c01207
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