小干扰RNA介导的基因默化是一种很有前景的治疗方法。在此，作者报告了通过三组分一锅反应在环境中合成带正电的亚胺连接的共价有机框架。通过阴离子交换和siRNA吸附，得到多功能siRNA@ABMBP-COF具有HK2抑制剂3-溴丙酮酸和SLC7A11 siRNA，通过铁下垂和凋亡途径对纤维肉瘤具有强大的协同抗肿瘤活性。

小干扰 RNA (siRNA) 是强大的实验室工具，可以特异性抑制靶向基因的表达。siRNA 疗法的临床转化由于其负电荷、高分子量（约 14 kDa）、易于降解和各种递送载体（包括病毒、蛋白质、 脂质体、 聚合物、 金属有机框架、无机纳米颗粒、和细胞外囊泡，已被开发用于将 siRNA 转运到细胞中。然而，有限的加载量、溶酶体逃逸不足以及难以与其他疗法协同作用极大地阻碍了它们在肿瘤治疗中的应用。因此，设计用于高效 siRNA 递送的新一代载体是紧迫而重要的。

自Yaghi等人2005年的开创性工作以来，共价有机框架（COF）作为一类多孔材料，在药物传递、蛋白质封装、光疗、和免疫治疗方面显示出巨大潜力。原则上，COF可以吸附核酸以生成核酸acid@COFs用于肿瘤治疗。然而，核酸acid@COFs从未用于抗肿瘤治疗，这也可能是由于核酸负载量极低。作者假设，通过合成带正电的COF载体可以克服这个瓶颈，其中带负电的治疗性siRNA的负载量可以通过静电相互作用显著提高。此外，阳离子COF中的反离子可以通过离子交换用带负电的代谢抑制剂和化疗药物取代。因此，逻辑上可以实现基于COF的多功能siRNA传递和代谢治疗。

迄今为止，已报道的阳离子 COF 通常由带正电的单体合成，包括溴化乙锭、碘化丙锭、咪唑鎓、季铵盐、和胍盐，这些结构都是在苛刻的溶剂热条件下，这种耗能且繁琐的方法不利于大规模合成。在此，作者报告了通过三组分一锅反应（方案 1A）的体系下合成亚胺连接的阳离子 ABMI-COF。通过碘化物抗衡离子与 3-溴丙酮酸（一种己糖激酶 2 (HK2)）的离子交换抑制剂，生成多功能性的ABMBP-COF。ABMI-COF 和 ABMBP-COF 都具有高 siRNA 吸附能力（大于 1 nmol mg-1）并且可以逃逸溶酶体。更重要的是，载有溶质载体成员(SLC7A11) siRNA 后， siRNA@AMBBP-COF 可以默化 SLC7A11 并抑制 HK2，从而通过铁死亡和细胞凋亡实现体外和体内抗肿瘤作用。

方案 1：(A) ABMI-COF 和 ABMBP-COF 的合成。(B) 表面吸附 siRNA 的 ABMBP-COF 通过抑制 SLC7A11 表达和 HK2 活性诱导铁死亡和细胞凋亡。

作者受 Raston 等人报道的有机反应的启发， 用1,3,5-三(4-氨基苯基)苯 (TAPB)、苯-1,3,5-三甲醛 (BTA) 和碘甲烷在 CH3CN 中的反应在室温下 24 小时后，用乙酸催化合成ABMI-COF，产率为78%。并对其结构形貌进行了表征（图1）。

图 1：ABMI-COF 的表征。(A) 实验（黑色）、Pawley 精制（红色）和模拟（黄色和绿色）PXRD 图案和差异图（灰色）；(B) 结构表示；(C) 77 K 下的氮吸附-解吸等温线和孔径分布（插图）；(D) SEM 图像。

由于亚胺键，ABMI-COF 和 ABMBP-COF 分别具有 +28.2 和 +25.0 mV 的正 zeta 电位，这使得这些纳米粒子具有高吸附带负电荷的 siRNA 的能力。在吸附 siRNA 后，纳米粒子的 zeta 电位下降到吸附前的约 60%，而基于 DLS 测量的流体动力学直径几乎没有变化，表明 siRNA 吸附不会导致显着的粒子凝聚。不出所料，由于正电荷引起的细胞膜亲和力和质子海绵效应， siRNA@ABMI-COF和siRNA@ABMBP-COF在4小时内通过胞饮作用轻易进入HT-1080细胞，然后从溶酶体逃逸到细胞质中（图2A）。根据 CCK-8 细胞活力测定，与未治疗组相比，siRNA@AMBBP-COF（40 μg mL-1，COF equiv.）将 HT-1080 细胞活力降低至 34.5 ± 2.2%，明显优于 siRNA@ABMI -COF (70.3 ± 8.8%)、ABMBP-COF (73.8 ± 2.8%) 和 ABMI-COF (90.5 ± 6.6%)，表明 SLC7A11 siRNA 和 3-溴丙酮酸的联合作用（图 2B）。研究了阳离子COF基纳米药物诱导的细胞死亡机制。加载 SLC7A11 siRNA 后，siRNA@ABMI-COF 和 siRNA@AMBBP-COF 降低了 SLC7A11 的表达（图 2C）。值得注意的是，ABMBP-COF 处理导致 GSH 耗竭、ROS 上调和线粒体损伤，但没有上调丙二醛含量或下调 GPX4表达式（图 2C）。这些结果表明，3-溴丙酮酸通过另一种机制诱导细胞死亡。用 ABMBP-COF 和 siRNA@AMBBP-COF 处理 48 h 后，HT-1080 细胞中 HK2 活性降低至对照组的 30% 以下（图 2D），并通过免疫荧光染色检测到 caspase 3 活化（，表明释放的3-溴丙酮酸通过触发细胞能量应激诱导细胞凋亡。细胞拯救实验进一步验证了铁死亡和细胞凋亡，其中不同的功能分子被添加到培养基中，并与 siRNA@AMBBP-COF 处理的 HT-1080 细胞一起培养（图 2E）。

图 2 铁死亡和凋亡相关的细胞死亡

根据所得结果，使用植入BALB/c裸鼠的HT-1080人纤维肉瘤异种移植模型评估了体内抗肿瘤活性。在肿瘤内注射纳米药物（0.8 mg mL）后第10天收集肿瘤−结果表明，抗肿瘤治疗效果按以下顺序增强：ABMI-COF，siRNA@ABMI-COF、ABMBP-COF和siRNA@ABMBP-COF（图3A和B）。siRNA@ABMBP-COF明确地将肿瘤体积减少到治疗前的60%左右，而siRNA@ABMI-COFABMBP-COF具有较差的抗肿瘤作用，ABMI-COF几乎没有抗肿瘤作用（图3C）。治疗结束时采集的苏木精-伊红（H＆E）染色肿瘤组织的组织病理学分析表明，肿瘤组织的组织学形态siRNA@ABMBP-COF-treated肿瘤与对照组显著不同，表现为广泛的细胞膜破裂、核收缩和松散排列的细胞，表明细胞受损（图3D）。Ki67是一种与细胞增殖和癌症预后相关的核抗原，是衡量癌细胞增殖潜力的细胞标记物。免疫组织化学染色结果（图3E）表明：siRNA@ABMBP-COF导致Ki67阳性细胞的比例低于ABMBP-COF和siRNA@ABMI-COF，表明抑制肿瘤增殖。这些实验结果与肿瘤生长曲线的趋势一致。铁死亡抑制剂 liproxstatin-1 (Lip-1) 明显抵消了 siRNA@AMBBP-COF 诱导的肿瘤治疗效果（图 3A-E）。

图 3：HT-1080荷瘤裸鼠体内抗肿瘤性能

总之，作者报道了在环境条件下通过三组分一锅反应合成亚胺连接的带正电的 COF。通过阴离子交换和 siRNA 吸附，所得的多功能 COF 纳米药物通过铁死亡和凋亡对 HT-1080 肿瘤细胞和组织发挥有效的联合抗肿瘤活性。该研究不仅丰富了 COF 合成方法，而且突出了阳离子 COF 作为 siRNA 介导的联合治疗的有前景的平台。