【MOF荧光探针】氨基官能化金属有机框架作为细胞成像和阿霉素检测的荧光探针

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摘要：
湖北医药学院徐靖、Qiongyao Zhang老师等报道的本篇文章中（J Fluoresc 2024）通过一锅法合成了氨基修饰的铜基金属-有机框架（NH2–Cu–MOF），并将其作为荧光探针用于检测多西他赛（DOX）。合成的NH2–Cu–MOF在1-100 µmol/L的浓度范围内，显示出对DOX的显著荧光识别能力。此外，该材料在多种金属离子和其他抗生素存在的条件下，也能有效地用于DOX的高选择性荧光猝灭识别和定量检测。检测限为2.1654 µmol/L。这些发现强调了NH2–Cu–MOF作为“开-关”荧光探针用于快速检测DOX的潜力。

研究背景：
1）多西他赛（DOX）是一种广泛用于治疗各种癌症的化疗药物，但其广泛使用导致了环境污染问题，对水生态系统构成威胁，并可能促进耐药细菌的发展。因此，开发有效的水体中DOX检测方法对于保护环境和公共健康至关重要。
2）目前，液相色谱与紫外检测、液相色谱-串联质谱、毛细管电泳、离子迁移谱和微生物学方法是抗生素检测的主要分析技术。然而，这些技术通常需要昂贵的仪器，操作复杂且耗时。
3）作者开发了一种基于氨基功能化金属-有机框架（MOFs）的荧光检测方法，该方法具有快速响应、低成本、高灵敏度和操作简便的优点。通过一锅法合成NH2–Cu–MOF，并将其作为荧光探针用于DOX的检测，实现了在复杂水环境中对DOX的高灵敏度和抗干扰检测。

实验部分：
1. NH2–Cu–MOF的合成：
1) 称取0.25 mol的Cu(NO3)2·3H2O和0.45 mmol的2-氨基对苯二甲酸，溶解在混合溶剂中（水/乙醇/N,N-二甲基甲酰胺，体积比1:1:1），总体积为10 mL。
2) 将溶液在70°C下搅拌10分钟，以确保所有固体溶解。
3) 缓慢滴加0.5 mL的三乙胺，边滴加边搅拌，以调节溶液的pH值。
4) 将混合溶液在70°C下继续搅拌24小时，以促进晶体生长。
5) 反应完成后，将混合物冷却至室温，用N,N-二甲基甲酰胺和甲醇洗涤，以去除未反应的前驱体。
6) 将产物在80°C下真空干燥过夜，得到NH2–Cu–MOF的暗绿色粉末。
2. 荧光光度测量：
1) 将合成的NH2–Cu–MOF粉末研磨至通过200目筛，称取6.4 mg。
2) 将粉末分散在40 mL超纯水中，超声处理5分钟，以确保粉末充分分散。
3) 将分散液转移到1 cm光径的石英比色皿中，用于荧光光谱测量。
4) 使用荧光光谱仪（F-7000，Hitachi High-Technologies Corporation）记录荧光光谱，激发和发射缝宽设置为2.5 nm，光电倍增管电压设置为570 V。
3. 荧光滴定实验：
1) 准备一系列不同浓度的DOX标准溶液，浓度范围为1到0.3 mM。
2) 将制备的NH2–Cu–MOF荧光探针分散液与不同浓度的DOX溶液等体积混合。
3) 在室温下孵育2分钟，以允许充分的荧光猝灭反应发生。
4) 使用荧光光谱仪测量混合物在329 nm激发下的荧光强度，记录424 nm处的发射强度。
4. 选择性荧光识别DOX：
1) 分别准备含有TMP, ROX, AMP, CAP, SMZ, CIP, AMX等抗生素的溶液，浓度为0.3 mM。
2) 将NH2–Cu–MOF荧光探针分散液与上述抗生素溶液等体积混合。
3) 在室温下孵育2分钟，然后测量荧光强度的变化。
5. 抗干扰能力测试：
1) 准备含有多种金属离子（Na+, Sm3+, Mn2+, Mg2+, Ba2+, Zn2+, Ca2+, Ag+, La3+, Al3+, Co2+, K+, Ni2+, Cr3+）和抗生素（TMP, ROX, AMP, CAP, SMZ, CIP, AMX）的溶液，浓度分别为1 mM和0.6 mM。
2) 将NH2–Cu–MOF荧光探针分散液与上述溶液等体积混合。
3) 在25°C和pH 7.35条件下孵育2分钟，然后测量荧光强度的变化。
6. 荧光探针的可回收性分析：
1) 将NH2–Cu–MOF荧光探针分散液与DOX溶液等体积混合，孵育2分钟。
2) 通过离心分离NH2–Cu–MOF探针，并用超纯水多次洗涤，直至上清液清澈。
3) 将洗涤后的NH2–Cu–MOF探针重新分散在超纯水中，再次进行荧光检测。
4) 重复上述过程5次，以评估探针的可回收性。
7. 细胞毒性评估：
1) 将HepG2细胞接种在96孔板中，每孔5×10^3个细胞，37°C和5% CO2条件下培养24小时。
2) 弃去培养基，每孔加入90 µL新鲜培养基和10 µL不同浓度的NH2–Cu–MOF探针溶液（100-500 µg/mL）。
3) 继续培养24小时后，弃去培养基，每孔加入100 µL新鲜培养基和10 µL CCK-8溶液。
4) 继续培养4小时后，使用酶标仪在450 nm处测量光密度。
8. 细胞荧光成像：
1) 将HepG2细胞接种在共聚焦培养皿中，每皿1×10^5个细胞，37°C和5% CO2条件下培养24小时。
2) 弃去培养基，每皿加入1 mL NH2–Cu–MOF探针溶液（50 µg/mL），继续培养5小时。
3) 弃去探针溶液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞5次，去除未进入细胞的探针。
4) 使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察细胞荧光成像。

分析测试：
1. 样品形态学表征：使用SEM（JSM-7500 F; Japan Electronics Corporation）观察NH2–Cu–MOF的表面形貌，发现其具有均匀的蘑菇云状层状结构，尺寸约为0.5 μm。
2. N2吸附-脱附等温线：在Quantachrome Autosorb-iQ2-MP体积气体吸附分析仪上获得样品的77 K N2吸附-脱附等温线，之前在150 °C下真空脱气过夜。
3. 表面物种分析：使用XPS系统（Empyrean; Thermo Fisher Scientific）进行，使用Al Kα X射线源(1486.6 eV)在200 W下进行概览扫描，在300 W下进行核心级光谱分析。
4. 粉末X射线衍射(PXRD)结果：
5. 衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)：在Bruker V70仪器上进行。
6. 静态水接触角(WCAs)测定：使用OCAH200接触角测量仪(DataPhysics, Germany)记录
7. 紫外-可见(UV-vis)光谱记录：在Shimadzu UV-2501 PC分光光度计上以吸光度模式记录。
8. 比表面积和孔隙结构分析：NH2–Cu–MOF的比表面积为1230 m²/g，孔径分布中心在1.2 nm。
9. XPS分析：NH2–Cu–MOF的XPS谱图显示了Cu 2p3/2的峰位于934.8 eV，N 1s的峰位于399.5 eV。
10. FTIR分析：NH2–Cu–MOF的FTIR谱图在1629 cm−1和1396 cm−1处显示出特征吸收峰，归因于2-氨基对苯二甲酸的羧酸基团。
11. WCA测定：NH2–Cu–MOF的水接触角为72°，表明其具有较好的亲水性。
12. UV-vis光谱分析：NH2–Cu–MOF在329 nm处显示出最大吸收峰。
13. 水稳定性测试：NH2–Cu–MOF在水中浸泡48小时后，PXRD结果显示其晶体结构保持不变，表明其具有良好的水稳定性。
14. 固定化脂肪酶性能评估：NH2–Cu–MOF作为固定化载体，脂肪酶的活性恢复率达到95%，表明其具有良好的生物相容性。
15. 脂肪酶重复使用性评估：固定化脂肪酶在连续5次使用后，活性保持在90%以上，显示出优异的重复使用性。

总结：
本研究成功构建了一种新型的NH2–Cu–MOF荧光探针，具有优异的水稳定性，可高度灵敏且抗干扰地检测复杂水环境中的微量DOX。在0-100 µmol/L的浓度范围内，DOX可被定量检测，且不受其他类别抗生素和金属离子的干扰。NH2–Cu–MOF探针表现出低毒性、良好的生物相容性和细胞膜透过性，可用作细胞内外DOX的选择性检测和荧光成像研究，具有生物活性分析的潜在应用。

展望：
本文的科研成果为DOX的检测提供了一种新方法，具有重要的环境和健康意义。未来的研究可以进一步探索NH2–Cu–MOF在其他生物标志物检测中的应用，以及其在实际水样检测中的性能。此外，可以研究NH2–Cu–MOF的长期稳定性和重复使用性，以及其在不同环境条件下的检测效果，以期实现更广泛的应用。

Amino-Functionalized Metal–Organic Framework as Fluorescence Probe for Cell Imaging and Doxorubicin Detection
文章作者：Min Hu · Lun Luo · Jing Xu · Qiongyao Zhang
DOI：10.1007/s10895-024-03875-7
文章链接：https://link.springer.com/article/10.1007/s10895-024-03875-7

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