【大孔MOF固酶】双酶级联反应在分级多孔MIL-53中的共固定化，用于高效生产6′-唾液酸乳糖

首页 > 行业动态 > 【大孔MOF固酶】双酶级联反应在分级多孔MIL-53中的共固定化，用于高效生产6′-唾液酸乳糖

摘要：
1. 中国科学院李建军、杜昱光老师等报道的本篇文章（Nanoscale, 2024）中成功开发了一种层级多孔材料MIL-53（HP-MIL-53），用于共固定化CMP-唾液酸合成酶（NmCSS）和α-2,6-唾液酸转移酶（Pd26ST），以高效合成6'-唾液乳糖（6-SL），这是一种在人乳寡糖中含量最丰富的唾液酸化形式，在婴儿配方奶粉中具有潜在的应用价值。
2. 通过简便的策略，将这两种酶共固定化于HP-MIL-53中，制备的生物反应器展现了高酶固定化容量（达到226 mg g−1），以及相较于自由酶更高的初始催化效率和在热稳定性、pH稳定性和储存稳定性方面的优势。经过13次循环使用后，6-SL的产率仍然保持在80%以上。本研究中的HP-MIL-53在工业上有用于6'-SL和其他糖类的酶催化合成的应用前景。

研究背景：
1. 人乳寡糖（HMOs）是人乳中第三丰富的固体物质，具有调节肠道菌群、防止病原体粘附、刺激适应性免疫发展等重要作用。其中，6'-唾液乳糖（6-SL）是最常见的唾液酸化HMO，占HMOs的约6%。6-SL在婴儿配方奶粉中具有潜在应用价值，但其合成方法存在挑战。
2. 6-SL的合成方法包括化学合成和生物合成。化学合成由于反应条件苛刻、保护和去保护操作繁琐，逐渐被酶合成方法所取代。酶合成方法虽然具有温和的反应条件，但酶的热稳定性低、成本高、可重复使用性差。
3. 本文作者提出了一种简便的策略，通过将CMP-唾液酸合成酶和α-2,6-唾液酸转移酶共固定化到层级多孔MIL-53（HP-MIL-53）中，构建级联生物反应器，用于酶合成6-SL。这种策略不仅提高了酶的固定化容量，还显著提高了酶的催化效率、热稳定性、pH稳定性和储存稳定性。

实验部分：
1. 酶的克隆、表达和纯化：
   1) 将编码NmCSS和Pd26ST的基因通过北京基因组研究所合成并克隆到pET-22b(+)和pET-28a(+)中。
   2) 使用分子克隆试剂盒，按照先前文献的方法诱导重组菌株表达目标酶。
   3) 通过离心、超声和亲和层析利用Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱纯化目标酶，使用Bradford试剂盒测定酶浓度，并通过SDS-PAGE验证纯度。
2. MIL-53和HP-MIL-53的合成：
   1) 按照文献方法合成MIL-53，将Al(NO3)3·9H2O和BDC在220°C下反应3天。
   2) 通过调节Al3+/BDC/十二酸的摩尔比，添加不同量的十二酸合成HP-MIL-53，反应条件为130°C下3天。
   3) 通过离心、洗涤和溶剂激活步骤，获得最终的MOF材料。
3. 酶@HP-MIL-53的制备及固定化容量评估：
   1) 调整NmCSS和Pd26ST的摩尔比，研究其对固定化容量的影响，保持NmCSS摩尔数为6 nmol。
   2) 将NmCSS、Pd26ST和HP-MIL-53在4°C下搅拌2小时，通过离心和洗涤得到NmCSS&Pd26ST@HP-MIL-53。
   3) 使用Bradford试剂盒测定残留酶浓度，评估HP-MIL-53对酶的固定化容量。
4. 荧光标记NmCSS和Pd26ST：
   1) 分别使用FITC和RhB对NmCSS和Pd26ST进行荧光标记。
   2) 将标记后的酶与HP-MIL-53混合，通过CLSM获取共固定化酶的荧光图像。
5. 酶活性测定：
   1) 在含有固定化酶和底物的缓冲液中进行级联反应，监测6'-SL的合成。
   2) 使用ELSD检测器的液相色谱系统分析6'-SL的形成。
6. 热、pH、储存稳定性和可重复使用性测试：
   1) 在不同温度和pH值下孵育固定化酶和自由酶，评估热稳定性和pH稳定性。
   2) 在室温下储存酶样品，定期检测酶活性，评估储存稳定性。
   3) 通过连续催化循环评估固定化酶的重复使用性，测量6'-SL的产率。

分析测试：
1. 材料表征：
   1) 使用SEM和TEM观察样品的表面形貌和结构。
   2) 通过氮气吸附-脱附等温线测定比表面积、孔容和孔径分布，使用DFT方法计算孔径。
2. 荧光标记酶的CLSM图像：
   1) 通过CLSM获取FITC-NmCSS和RhB-Pd26ST共固定化在HP-MIL-53上的荧光图像。
3. 酶活性和产物分析：
   1) 使用液相色谱系统配备ELSD检测器监测6'-SL的形成，并定量分析产率。
4. 热稳定性测试：
   1) 在不同温度下孵育固定化酶和自由酶，测定剩余活性，评估热稳定性。
5. pH稳定性测试：
   1) 在不同pH值下孵育固定化酶和自由酶，测定催化效率，评估pH稳定性。
6. 储存稳定性测试：
   1) 在室温下储存固定化酶和自由酶，定期检测酶活性，评估储存稳定性。
7. 可重复使用性测试：
   1) 通过连续催化循环评估固定化酶的重复使用性，记录每次循环后的6'-SL产率。
8. 比表面积和孔隙结构分析：
   1) 测定HP-MIL-53的比表面积、孔容和孔径分布，比表面积达到226 mg g−1。
9. 荧光标记效率：
   1) 通过CLSM图像确认FITC-NmCSS和RhB-Pd26ST的成功共固定化。
10. 酶动力学参数：
    1) 测定固定化和自由NmCSS及Pd26ST的Michaelis-Menten动力学参数，包括Km、kcat和kcat/Km值。
11. 热稳定性、pH稳定性和储存稳定性的具体数值：
    1) 在45 °C和50 °C下，NmCSS&Pd26ST@HP-MIL-53分别保留了65.4%和42.2%的初始活性，而自由酶分别保留了32.1%和6.3%。
    2) 在pH 3.0–8.0范围内，固定化酶和自由酶的催化效率随pH值增加而提高，固定化酶在pH 8.0–10.0范围内显示出更高的pH稳定性。
    3) 在室温下储存20天后，固定化酶保留了76%的残余活性，而自由酶保留了63%。
12. 可重复使用性的具体数值：
    1) NmCSS&Pd26ST@HP-MIL-53在13次催化循环后6'-SL产率保持在>80%，但在第13次循环后催化性能显著下降。】

总结：
1. 本研究成功构建了NmCSS和Pd26ST共固定化的HP-MIL-53(20)级联生物反应器，展示了高酶载量、优异的催化活性和出色的稳定性。
2. HP-MIL-53(20)的介孔结构为酶提供了更多的空间和较短的中间产物扩散距离，从而提高了催化效率。HP-MIL-53(20)的晶体骨架保护酶免受高温和酸碱环境的影响。
3. 生物催化剂在室温下储存20天后仍保持76%的残余活性，在13次催化循环后仍保持80%的残余活性。

展望：
本研究为6'-SL的工业化生产提供了一种新的策略，具有重要的应用前景。未来的研究可以进一步优化酶的固定化条件，提高酶的稳定性和催化效率。同时，可以探索HP-MIL-53(20)在其他类型HMOs和糖苷合成中的应用，扩展其在工业生产中的应用范围。此外，研究者还可以探索HP-MIL-53(20)在其他生物催化反应中的应用，进一步验证其多功能性和通用性。

Co-immobilization of a bi-enzymatic cascade into hierarchically porous MIL-53 for efficient 6′-sialyllactose production†
文章作者： Xinlv Peng, Caixia Pei, Eika W. Qian, Yuguang Du* and Jian-Jun Li *
DOI: 10.1039/d4nr01775g
文章链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2024/nr/d4nr01775g

本文为科研用户原创分享上传用于学术宣传交流，具体内容请查阅上述论文，如有错误、侵权等请联系修改、删除。未经允许第三方不得复制转载。