【MOF固酶】单晶有序纳米多孔金属-有机框架用于脂肪酶固定化和结构脂质生产

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摘要：
清华大学杜伟老师等报道的本篇文章（ACS Appl. Nano Mater. 2024）中研究了一种新型的单晶有序大-微孔CuBTC金属-有机框架（MOF），作为脂肪酶固定化载体，因其卓越的质量传递性能和高脂肪酸稳定性而显示出巨大潜力。然而，其实际应用受到了其在水中稳定性差的限制。为了解决这一问题，作者引入了一种已知的疏水配体1,2,3-苯三唑（BTA），它与铜有很强的配位能力。成功合成了一系列具有增强疏水性和改善水稳定性的CuBTC衍生双配体SOM-MOFs（称为SOM-MIXs）。这些材料在脂肪酶固定化方面表现出色，特异性活性最大增加了66.9%。为了克服过量添加1,2,3-苯三唑不会进一步增强载体的疏水性并可能导致结构损伤的限制，作者采用了溶胶-凝胶法将SOM-MIXs涂覆上高度疏水的PDMS，使特异性活性进一步提高了139.1%。所得固定化脂肪酶在合成1-油酸-2-棕榈酸-3-亚油酸甘油酯（OPL）过程中显示出卓越的催化性能和显著的可重复使用性，在五个酸解循环后活性保持率为90.09%。这项工作突出了SOM-MIX@PDMS的潜力，并为合理设计和后修饰MOFs以固定化酶在多种应用中提供了有价值的见解。

研究背景：
1. 在油脂和脂肪的转化与升级过程中，酶固定化技术是关键，但传统的MOFs作为酶载体在水稳定性和大分子酶固定化方面存在限制。
2. 其他研究者已经提出多种MOFs结构和性质的调控策略，例如通过后合成修饰改善MOFs的疏水性和稳定性。
3. 本文作者在前人研究的基础上，通过引入1,2,3-苯三唑（BTA）作为第二配体，增强了MOFs的疏水性和水稳定性，并通过PDMS涂层进一步提高了脂肪酶的固定化效率和催化性能。

实验部分：
1. SOM-CuBTC和SOM-MIX的合成：
1) 将Cu(NO3)2·3H2O、BTC和1,2,3-BTA按照不同的摩尔比例溶解在7.5 mL二甲基亚砜中，缓慢加入等体积的乙醇，搅拌下获得均匀的前驱体溶液。
2) 将制备的PS模板浸入前驱体溶液中，在真空中脱气30分钟，然后在60 °C真空下干燥8小时，获得前驱体@PS。
3) 将含有HCOONa·2H2O的水和乙醇混合溶液（1:1, v/v, 15 mL）在真空中渗透到干燥的前驱体@PS中，反应12小时，随后用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)多次洗涤以去除PS模板，最后用乙醇浸泡并在60 °C真空下干燥过夜，得到SOM-MOF。
2. PDMS涂层的制备：
1) 将0.6 g Sylgard 184硅橡胶基材溶解在10 mL正己烷中，0.06 g固化剂溶解在2 mL正己烷中，混合后超声分散约50 mg SOM-MOF粉末于该溶液中15分钟。
2) 混合物沉淀、离心、在30 °C下空气干燥2小时，然后在60 °C下固化过夜，得到SOM-MOF@PDMS。
3. 脂肪酶的固定化：
1) 将预先用乙醇浸渍的30 mg载体加入到由800 μL水和200 μL游离脂肪酶组成的混合溶液中，在40 °C和200 rpm下孵育4小时。
2) 通过5000 rpm离心3分钟收集固定化脂肪酶，用水洗涤一次，最终冷冻干燥。得到的固定化脂肪酶和上清液存放在4 °C下进行进一步分析。
4. 水稳定性测试：
1) 将5 mg载体和1.5 mL水加入到2 mL离心管中，在60 °C和250 rpm下振荡4小时。
2) 随后离心并冷冻干燥载体，比较测试前后粉末X射线衍射(PXRD)的变化以评估水稳定性。
5. 固定化脂肪酶的重复使用性评估：
1) 在相同的条件下，通过连续24小时批次的酸解反应评估固定化脂肪酶的重复使用性，用于合成OPL。
2) 每个周期后，通过离心回收生物催化剂，然后直接引入下一个批次反应中。通过24小时酸解后甘油三酯中PA含量的减少来测量活性。每次运行后剩余的脂肪酶活性相对于初始值100%进行归一化。

分析测试：
1. 样品形态学表征：使用Zeiss场发射扫描电子显微镜(SEM)检查样品形态。
2. N2吸附-脱附等温线：在Quantachrome Autosorb-iQ2-MP体积气体吸附分析仪上获得样品的77 K N2吸附-脱附等温线，之前在150 °C下真空脱气过夜。
3. 表面物种分析：使用X射线光电子能谱(XPS)系统(Axis Supra, Kratos Analytical Ltd., UK)进行，使用Al Kα X射线源(1486.6 eV)在200 W下进行概览扫描，在300 W下进行核心级光谱分析。
4. 粉末X射线衍射(PXRD)结果：使用Rigaku MiniFlex X射线衍射仪和Cu Kα辐射，扫描速度为10°/min获得。
5. 衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)：在Bruker V70仪器上进行。
6. 静态水接触角(WCAs)测定：使用OCAH200接触角测量仪(DataPhysics, Germany)记录。
7. 紫外-可见(UV-vis)光谱记录：在Shimadzu UV-2501 PC分光光度计上以吸光度模式记录。
8. 比表面积和孔隙结构分析：SOM-CuBTC和SOM-MIXs的比表面积分别为191.4, 207.7, 184.6, 和 189.2 m²/g，孔径分布中心在~2 nm。
9. XPS分析：SOM-MIX31的XPS谱图显示了N 1s的强烈峰，Cu 2p3/2区域的峰向较低的结合能移动，表明Cu变得更电负。
10. FTIR分析：SOM-MIXs的FTIR谱图在1000到1100 cm−1处的吸收增加，归因于三唑的N−H伸缩振动和苯环的存在。
11. WCA测定：SOM-MIXs相比SOM-CuBTC显示出更高的疏水性，水接触角显著增大。
12. UV-vis光谱分析：PDMS改性后SOM-MOF的表面振动结构发生了显著变化，FTIR谱图显示了PDMS特征吸收峰的显著增加。
13. 水稳定性测试：SOM-MOF@PDMS在333 K下浸水4小时后，晶体结构保持良好，显示出优异的水稳定性。
14. 固定化脂肪酶性能评估：SOM-MIX31@PDMS展示出最高的特异性活性和活性恢复率，酸解反应中表现出更高的反应速率和转化率。
15. 脂肪酶重复使用性评估：SOM-MIX21@PDMS@RML在五个酸解批次后保持了90.09%的活性，显示出优异的重复使用性。

总结：
本文通过合成新型的双配体SOM-MOF（SOM-MIX）并进行PDMS涂层改性，显著提高了脂肪酶的固定化效率和催化性能。SOM-MIX@PDMS在水稳定性、疏水性、催化效率和重复使用性方面均表现出色，为油脂和脂肪资源的可持续转化和升级提供了新的策略。

展望：
本研究为MOFs在生物催化领域的应用提供了新的思路，未来的工作可以从以下几个方面进行扩展：
1. 稳定性研究：进一步研究SOM-MIX@PDMS在更广泛的条件下的稳定性，包括在不同pH值和温度下的表现。
2. 规模化生产：探索SOM-MIX@PDMS的规模化生产方法，以降低成本并提高实际应用的可行性。
3. 应用拓展：将SOM-MIX@PDMS应用于其他类型的酶固定化，以及在生物医药、环境治理等领域的潜在应用。

Single-Crystalline Ordered Nanoporous Metal–Organic Frameworks for Lipase Immobilization and Structured Lipid Production
文章作者：Zeqing Liu, Yuhan Li, Lingmei Dai, Dehua Liu, and Wei Du*
DOI：10.1021/acsanm.4c03885
文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsanm.4c03885

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