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介孔COF纳米颗粒实现SiRNA肿瘤免疫治疗

摘要
北京理工大学王博、黄渊余、王渊博老师团队发表的研究J. Am. Chem. Soc. ，DOI:10.1021/jacs.6c10067中，采用刚性‑柔性平衡的连接基分子设计策略，合成系列介孔COF纳米颗粒。
1. 其中TECOF纳米颗粒拥有4.5 nm介孔孔径，是目前已报道COF纳米颗粒中孔径最大的材料。
2. 将还原响应Pt(IV)顺铂前药共价接枝在TECOF表面，孔道内部包载siPDL1得到siPDL1@TECOF‑Pt。在4T1荷瘤小鼠模型中显著抑制肿瘤的效果。

研究背景
1. 行业问题：
siRNA是极具潜力的肿瘤免疫治疗方法，但siRNA多聚阴离子属性，必须依赖递送载体。现有LNP载体存在热稳定性差、储存运输困难；MOF、介孔二氧化硅、高分子等载体存在siRNA负载效率不足、生物安全性缺陷。
2. 现有方案：
构建同时具备纳米尺度、高结晶、大有序介孔的2D‑COF颗粒难度高，长链刚性配体溶解性差，易得到块体沉淀，难以用于双链siRNA（7‑8 nm长）包载。
3. 本文创新：
1) 在刚性长配体上接枝柔性烯丙氧基侧链，兼顾配体溶解性与层间相互作用，快速均相成核得到高结晶大介孔COF纳米颗粒；
2) 实现孔道包载siRNA、表面共价接枝Pt(IV)前药的空间分区共装载，构建化疗‑siRNA联合免疫纳米平台，同时该材料可冻干室温保存，弥补LNP储存短板。

实验部分
1. 系列介孔COF纳米颗粒合成：
1) 以1,3,5‑三(4‑氨基苯基)苯为氨基单体，分别和三种烯丙氧基修饰二醛发生席夫碱缩合，乙腈为溶剂，加入PVP调控粒径，得到TTCOF、TDCOF、TECOF三种单分散COF纳米颗粒，粒径150‑260 nm。
2) 不引入烯丙氧基侧链时只能得到无定形聚合物。后续通过EDC/NHS酰胺偶联将Pt(IV)顺铂前药共价接枝TECOF表面制备TECOF‑Pt。
2. siRNA装载与释放实验：
1) 琼脂糖凝胶阻滞、荧光定量测试siRNA负载性能；CuPc封堵孔道对照实验，证实siRNA主要封装于内部孔道；
2) TECOF的siRNA负载可达4.3 wt%，优于TTCOF（2.1 wt%）、TDCOF（2.9 wt%）以及多数已报道载体。
3. 细胞实验：
选用4T1乳腺癌细胞，CLSM、Bio‑TEM追踪细胞摄取与内体逃逸；多种内吞抑制剂判定摄取通路；qRT‑PCR、Western blot检测PD‑L1基因沉默效果；验证该载体基因沉默效率与LNP相当，载体本身细胞毒性低。
4. 动物实验：
建立4T1皮下荷瘤小鼠模型，分别开展瘤内注射、静脉给药两组体内治疗；siPDL1@TECOF‑Pt可以近乎完全抑制肿瘤进展，提升CD8⁺T细胞肿瘤浸润，生物相容性良好。
实验突破：实现孔径4.5 nm高结晶COF纳米颗粒制备；实现siRNA与铂前药空间分区共载；材料可冻干室温储存，体内实现化疗‑siRNA协同抗肿瘤免疫。

分析测试
1. 结构表征：
1) 固体¹³C CP/MAS NMR在152‑160 ppm出现亚胺碳信号；FT‑IR在1618 cm⁻¹观察C=N伸缩振动，证实亚胺键COF框架成功构筑。
2) TECOF接枝Pt(IV)后PXRD图谱无明显变化，晶体结构保持完整。SEM显示三种COF均为150‑260 nm球形纳米颗粒。
3. 吸附孔隙：
1) TTCOF BET=2512 m²/g，孔径3.0 nm；TDCOF BET=1792 m²/g，孔径3.9 nm；TECOF BET=1879 m²/g，孔径4.5 nm。
2) 包载siRNA之后TECOF比表面积由1879下降至1392 m²/g，佐证siRNA进入孔道。
4. 热重、ICP‑OES、EDS元素映射：
TGA与ICP‑OES测得TECOF‑Pt铂负载量分别为6.12 wt%、6.34 wt%；HAADF‑STEM‑EDS显示Pt、Cl元素均匀分布，证明Pt(IV)共价接枝。
5. ITC等温滴定量热：
siRNA封装为放热过程（ΔH<0），ΔG<0，表明包载热力学自发；熵变ΔS<0，siRNA进入孔道构象受限。

机理分析
1. 材料合成组装机理：
烯丙氧基柔性侧链一方面提升长刚性二醛配体溶解度，实现均相成核得到纳米颗粒；另一方面增强层间堆叠能，快速聚合条件下维持有序层堆叠，得到高结晶度大介孔COF纳米颗粒。缺少烯丙氧基修饰，配体溶解性不足，只能得到无定形聚合物。
2. siRNA装载结合机理：
1) COF与siRNA均带负电，静电排斥不利于吸附；主要驱动力为氢键与范德华相互作用。分子动力学模拟显示更大疏水孔道促使siRNA疏水碱基暴露，增加氢键数目，提升包载能力；
2) 盐离子屏蔽静电排斥、pH降低亚胺质子化，进一步提升负载。siRNA沿孔道轴向排布，靠近孔壁极性位点。
3. 细胞与体内治疗机理：
siPDL1@TECOF‑Pt通过小窝蛋白介导的能量依赖内吞进入细胞，质子海绵效应实现内体逃逸释放货物；胞内高GSH将Pt(IV)还原为顺铂，激活caspase‑3/GSDME通路诱导细胞焦亡，释放损伤相关分子模式促进树突状细胞成熟；
2) 孔道释放siPDL1下调肿瘤PD‑L1，解除免疫抑制，协同促进CD8⁺T细胞肿瘤浸润，实现抗肿瘤免疫。

总结
1. 本文利用刚性‑柔性协同的配体修饰策略，成功合成TTCOF、TDCOF、TECOF一系列大介孔COF纳米颗粒，TECOF实现4.5 nm的超大介孔孔径。
2. 通过后合成修饰在TECOF表面共价键合Pt(IV)前药，孔道封装siPDL1，实现两种功能组分空间分区装载。在4T1荷瘤小鼠瘤内注射和静脉给药均展现优异的化疗‑siRNA联合免疫抗肿瘤效果。

文章标题：Large-Mesopore Covalent Organic Framework Nanoparticles for Small Interfering RNA Delivery toward Cancer Immunotherapy
文章作者：Renzeng Chen; Haiyin Yang; Huiping Zhu; Lihua Wu; Zhitong Guo; Xi Yu; Jie Wang; Yuanbo Wang; Yuanyu Huang; Bo Wang
DOI：10.1021/jacs.6c10067
文章链接：https://pubs.acs.org/jacsat/article/doi/10.1021/jacs.6c10067

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北京理工大学王博、黄渊余、王渊博团队在JACS报道刚性‑柔性平衡配体策略制备4.5 nm大介孔TECOF纳米颗粒，实现孔道包载siPDL1、表面接枝Pt(IV)前药，诱导肿瘤细胞焦亡并沉默PD‑L1，在小鼠模型实现高效抗肿瘤免疫，材料可冻干室温保存。