细胞内原位合成共价有机框架用于触发铁死亡及免疫治疗

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摘要：
澳门大学王瑞兵教授团队发表的研究(Adv. Mater.，DOI: 10.1002/adma.202510663）中，首次建立溶酶体内酸性催化亚胺缩合的结晶聚合策略，在活肿瘤细胞溶酶体中原位合成共价有机框架（COFs，命名为 UMCOF1）。该材料具备本征荧光与规整晶体结构，可实时示踪合成过程；其在溶酶体内形成会破坏溶酶体稳态、活化溶酶体铁离子，触发免疫原性铁死亡，显著增强体内抗肿瘤免疫治疗效果。该方法无需高温、有机溶剂与严苛无氧条件，在水相温和条件下即可实现 COFs 合成，为活细胞内治疗性聚合反应开辟新方向。

研究背景：
1. 行业问题：活体内合成非天然聚合物可调控细胞功能，但细胞内原位合成COFs等结晶聚合物面临水环境干扰、结晶困难等挑战；细胞内复杂环境阻碍聚合，产物缺乏结晶度，无法作为治疗工具，目前尚无相关报道。
2. 现有方案：人工聚合聚合物可用于生物应用，COFs因优势已应用于生物成像等领域，但传统溶剂热合成条件苛刻，无法在细胞内温和合成，未探索其细胞内合成及抗肿瘤应用。
3. 本文创新：提出溶酶体内酸催化结晶聚合策略，用生物相容性单体在细胞溶酶体内原位合成亚胺连接COFs；利用其荧光特性追踪聚合过程，首次将其与铁死亡、免疫治疗结合，实现体内抗肿瘤治疗。

实验部分：
1. 缓冲液中常规COFs合成：
以苯胺与DMTP合成亚胺模型化合物（收率45%）；TAPB与DMTP为单体，在10 mM、pH 5.0磷酸盐缓冲液中37℃合成UMCOF1（收率76%），还合成UMCOF2-UMCOF5（收率27%-66%），pH 4.0-5.0时聚合6 h达平衡，产物结晶性良好。
2. 细胞内原位合成TAPB-DMTP COF：
1) 以4T1细胞为模型，将TAPB（50 µM）与DMTP（75 µM）溶于含吐温-80的培养基中与细胞共孵育反应，利用溶酶体内酸催化结晶聚合，并通过流式细胞术、共聚焦显微镜等监测荧光变化；
2) 用巴氟霉素A1（BafA1）预处理抑制溶酶体酸化，观察荧光变化。结果表明，细胞内荧光随孵育时间递增，BafA1预处理使荧光强度降至28%；
3) 通过生物TEM、小角PXRD验证细胞内COFs的结晶性；COFs主要在溶酶体合成（Pearson相关系数0.626），粒径约120 nm，
4) 采用CCK-8法检测细胞活力，探究不同细胞系（CT26、MCF7等）及正常细胞的毒性差异。所得COF材料微粒对肿瘤细胞有细胞毒性（IC50约44.3 µM），对正常细胞也有一定毒性。
3. 铁死亡诱导：
4T1细胞共处理后，诱导溶酶体碱化和膜通透性增加，胞内Fe(II)升高3倍，铁死亡抑制剂可拯救细胞，脂质过氧化显著升高，证实溶酶体介导的铁死亡。
4. 免疫原性及体内实验：
共处理诱导DAMPs持续释放，激活巨噬细胞和DC细胞；小鼠瘤内注射使肿瘤重量降至对照组19%，联合R848产生远位效应，肿瘤疫苗可预防BALB/c小鼠肿瘤形成。
实验突破：首次实现细胞内溶酶体原位合成结晶COFs，首次将其与免疫原性铁死亡结合，拓展COFs生物医学应用。

分析测试：
1. 结构与结晶性：UMCOF1为hcb网状、P3空间群，晶胞参数a=b=37.24 Å，c=3.53 Å，Pawley精修Rwp=3.84%、Rp=2.87%；细胞内COFs在2θ=2.74°有特征峰，HRTEM显示晶面间距3.5 Å，FT-IR验证亚胺键，TGA证实热稳定性。
2. 光学测试：UMCOF1可被405 nm激光激发，发射528 nm绿色荧光（寿命10.4 ns），最大吸收峰427 nm，pH 4.0-5.0聚合最快。
3. 细胞与体内表征：COFs与溶酶体共定位，BafA1预处理降低共定位；生物TEM观察到120 nm球形颗粒；小鼠瘤内注射后肿瘤损伤明显，GSH下降、MDA升高，IL6和TNFα升高，脾脏DC细胞增加4.9倍。

机理分析：
1. 细胞内原位合成COF机理：
依赖溶酶体酸性环境（pH 4.5-5.0），TAPB与DMTP经酸催化亚胺缩合、π-π堆积形成COFs，吐温-80促进单体溶解和摄取，BafA1预处理降低合成效率。
2. COF诱导铁死亡机制：
COFs形成及质子化导致溶酶体碱化、膜通透性增加，释放Fe(II)升高LIP，引发脂质过氧化，降低GSH、抑制GPX4，触发铁死亡，与传统诱导剂起源不同。
3. 免疫及抗肿瘤机理：
铁死亡导致细胞膜损伤，持续释放DAMPs，CALR膜表达是免疫原性关键；激活巨噬细胞和DC细胞，促进CD8+T细胞活化，联合R848产生远位效应，疫苗通过激活T细胞预防肿瘤。

总结：
1. 建立溶酶体内酸性催化原位结晶聚合新方法，首次在活细胞与肿瘤内合成结晶型 COFs，材料具备荧光示踪与规整结构。
2. 揭示溶酶体 COFs 合成→溶酶体损伤→铁离子释放→免疫原性铁死亡的完整机制，明确新型铁死亡途径。
3. 实现单体瘤内注射原位治疗，显著抑制肿瘤生长，联合免疫佐剂产生远端效应，可制备肿瘤疫苗，系统安全性良好。
4. 本研究为生物体催化COF合成提供新思路，打开了生物合成二维高分子聚合物的新窗口。

文章标题：In Situ Synthesis of Covalent Organic Frameworks Inside Cells for Triggering Ferroptosis and Immunotherapy
文章作者：Qun Guan, Le-Le Zhou, Zhiqing Yang, Yan-An Li, Leyong Wang, Ruibing Wang
DOI：10.1002/adma.202510663
文章链接：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202510663

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