【PFC-1/HOF-101】基于HOF@Au与DNA酶介导的DNA步行者信号放大器的高效SERS基底用于洛美沙星的超灵敏检测

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摘要：
重庆文理学院谢顺碧和西华大学Yi He老师等报道的本篇文章（Anal. Chem. 2025, 97, 5, 3180–3189）中提出了一种基于DNA酶介导的DNA步行者信号放大器与大量负载金纳米颗粒（Au NPs）的氢键有机框架（HOFs）作为表面增强拉曼散射（SERS）基底的检测方法，用于食品中洛美沙星（LOM）的超灵敏检测。HOFs因其高比表面积和强吸附能力，成为Au NPs原位生长的理想基底，展现出强大且均匀的SERS增强效果。当目标LOM存在时，DNA酶被激活，启动DNA步行者产生大量单链DNA，进一步触发催化发夹组装（CHA）循环。此外，Au@Ag@4-硝基苯硫酚（4-NTP）@Au@Hp3的多间隙核壳结构产生了更多SERS“热点”，显著增强了局域电磁场，HOF@Au协同增强了4-NTP的拉曼信号。基于此原理，该传感器通过“信号开启”策略实现了对LOM的超灵敏检测，检测限低至4.62×10⁻¹⁴ mol/L，为食品中抗生素的检测提供了新的思路。

研究背景：
1）洛美沙星（LOM）是一种广谱抗生素，过量摄入可能导致人体肝损伤、关节问题以及中枢神经系统损伤等不良反应。因此，开发一种能够对LOM进行高灵敏度检测的方法对于食品安全和公共卫生至关重要。
2）目前，检测LOM的方法包括电化学法、毛细管电泳法和高效液相色谱（HPLC）。这些方法虽然具有较高的灵敏度和选择性，但大多需要复杂的仪器和繁琐的样品前处理过程，限制了其广泛应用。因此，开发一种简单、灵敏的检测方法显得尤为重要。表面增强拉曼散射（SERS）作为一种高灵敏度、非破坏性的检测技术，因其快速分析和非破坏性特点而受到广泛关注。然而，传统的SERS基底（如金或银纳米颗粒）容易因样品中的盐、pH和有机溶剂而聚集，影响检测的准确性和灵敏度。
3）本文作者提出了一种基于氢键有机框架（HOFs）负载大量金纳米颗粒（Au NPs）的SERS基底，并结合DNA酶介导的DNA步行者作为信号放大器，实现了对LOM的超灵敏检测。HOFs具有高比表面积和强吸附能力，能够有效负载大量Au NPs，增强SERS信号。同时，通过DNA步行者和催化发夹组装（CHA）循环，进一步放大了信号，提高了检测灵敏度。此外，多间隙核壳结构的SERS标签（Au@Ag@4-NTP@Au）产生了更多“热点”，显著增强了局域电磁场，从而实现了对LOM的超低检测限（4.62×10⁻¹⁴ mol/L）。

实验部分：
1）HOF@Au的制备：
将TBAPy（150 mg）溶解于22.5 mL DMF中，超声处理使其均匀分散，随后加入90 mL甲醇，搅拌5分钟。
将上述溶液在27℃下静置12小时，使HOF-101纳米棒形成。
通过离心（8000 rpm，10分钟）收集沉淀，用甲醇洗涤三次，干燥后得到HOF-101。
将35 mg HOF-101纳米棒分散于15 mL甲醇中，加入10 mL 1 mmol/L HAuCl₄溶液和1 mL 60 mg/mL的柠檬酸钠溶液，搅拌反应6小时。
反应完成后，用超纯水和甲醇交替洗涤产物三次，干燥后得到HOF@Au。
Au@Ag@4-NTP@Au@Hp3（SERS标签）的制备：
2）合成Au种子：将15 mL 1%（w/w）柠檬酸钠溶液加入100 mL 1 mmol/L HAuCl₄溶液中，85℃搅拌15分钟。
3）在Au种子表面沉积Ag壳：将0.6 mL 0.1 mol/L抗坏血酸、0.4 mL 0.2 mol/L CTAC和1 mL超纯水加入4 mL Au种子溶液中，随后加入0.3 mL 10 mmol/L AgNO₃溶液，60℃反应2小时。
通过离心（8000 rpm，5分钟）收集Au@Ag纳米颗粒，用超纯水洗涤三次。
将100 μL 1 mmol/L 4-NTP溶液加入Au@Ag纳米颗粒中，室温下反应过夜，形成Au@Ag@4-NTP。
将4 mL Au@Ag@4-NTP溶液与0.2 mol/L CTAC溶液（0.2 mL）、0.1 mol/L抗坏血酸溶液（0.3 mL）和50 mmol/L HAuCl₄溶液（0.01 mL）混合，60℃反应2小时，形成Au@Ag@4-NTP@Au。
通过离心（8000 rpm，5分钟）收集产物，用超纯水洗涤后分散于水中。
将2 μmol/L Hp3（500 μL）加热至95℃保持5分钟，然后缓慢冷却至25℃，形成发夹结构。
将500 μL Au@Ag@4-NTP@Au纳米颗粒加入500 μL 2 μmol/L Hp3溶液中，4℃反应16小时，得到最终的SERS标签Au@Ag@4-NTP@Au@Hp3。
4）DNA步行者探针的制备：
将100 μL 10 μmol/L Hp1加热至95℃保持5分钟，然后缓慢冷却至25℃，形成发夹结构。
将4 μL 20 μmol/L Zn²⁺特异性DNA酶和8 μL 20 μmol/L LOM aptamer与68 μL PBS缓冲液混合，加热至95℃保持5分钟，得到双链DNA特异性DNA酶（步行链）。
将3 mL 1 mg/mL磁性微球（MB）加入到3 mL 1 mmol/L EDC和2 mmol/L NHS的混合溶液中，反应1小时。
通过磁性分离三次后，加入100 μL 1 μmol/L步行链和100 μL 10 μmol/L H1，27℃反应3小时。
再次通过磁性分离三次，将产物分散于1.8 mL PBS缓冲液中，得到DNA步行者探针。
5）SERS检测过程：
将20 μL DNA步行者探针、5 μL 10 mmol/L ZnSO₄和5 μL目标LOM溶液与20 μL PBS缓冲液混合，37℃反应1小时。
通过磁性分离，将上清液转移至HOF@Au@Hp2复合物中。
加入10 μL SERS标签，37℃反应2小时，以促进CHA互补杂交，产生显著的SERS信号。

分析测试：
1）样品形态学表征：
使用Zeiss Sigma 300场发射扫描电子显微镜（SEM）检查HOF和HOF@Au的形态。HOF呈现纳米棒状结构，Au NPs均匀分布在HOF表面。
2）透射电子显微镜（TEM）分析：
使用JEOL JEM 1200EX透射电子显微镜观察Au、Au@Ag和Au@Ag@4-NTP@Au的结构。Au@Ag和Au@Ag@4-NTP@Au的核壳结构清晰可见，粒径分别为36.11 nm和44.69 nm。
3）X射线光电子能谱（XPS）：
使用Thermo Scientific XPS分析HOF@Au的表面元素组成。Au 4f结合能峰表明Au NPs成功负载于HOF表面。C 1s高分辨谱图显示284.8 eV处为sp²杂化碳峰，288.2 eV处为C−O结合能峰；O 1s高分辨谱图在532.1 eV处显示O−C键峰，531.6 eV和530.6 eV处分别为表面羟基和吸附氧的峰。
4）傅里叶变换红外光谱（FTIR）：
使用FTIR分析HOF和HOF@Au的官能团。HOF在3200−2500 cm⁻¹处的吸收带归因于OH基团的伸缩振动，1715 cm⁻¹处的吸收带归因于C=O的伸缩振动。HOF@Au的FTIR谱图与HOF相似，表明Au NPs的负载未显著改变HOF的结构。
5）比表面积和孔隙结构分析：
在77 K下通过N₂物理吸附测量HOF的比表面积，比表面积为614.69 m²/g，表明HOF具有较高的比表面积，为Au NPs的负载提供了大量吸附位点。
6）X射线衍射（XRD）：
使用XRD分析HOF和HOF@Au的晶体结构。HOF和HOF@Au在6.42°、8.82°、10.07°和13.21°处有特征峰，分别对应(110)、(020)、(2−20)、(130)和(1−40)晶面。HOF@Au在38.22°、44.54°、64.67°、77.58°和82.31°处出现额外峰，分别对应Au的(111)、(200)、(220)、(311)和(222)晶面。
7）紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）：
使用Shimadzu UV-2700紫外-可见分光光度计记录HOF和HOF@Au的吸收光谱。HOF在445 nm和485 nm处有吸收峰，HOF@Au在485 nm处的吸收峰发生红移，表明Au NPs成功负载于HOF表面。
8）SERS信号测试：
使用HORIBA XploRA PLUS拉曼光谱仪（785 nm激光激发源）测试SERS信号。在目标LOM存在时，SERS信号显著增强，检测限低至4.62×10⁻¹⁴ mol/L。在目标LOM不存在时，SERS信号较弱，表明该传感器具有良好的选择性。
9）zeta电位测试：
测试HOF、HOF@Au和HOF@Au@Hp2的zeta电位。HOF的zeta电位为-42.15 eV，HOF@Au的zeta电位进一步降低，HOF@Au@Hp2的zeta电位为-57.36 eV，表明Hp2成功修饰于HOF@Au表面。
10）稳定性测试：
将SERS传感器在不同时间（0、1、5、10和15天）储存后进行SERS强度测试。结果显示，传感器在5天后SERS强度略有下降，表明传感器在测试期间具有良好的稳定性。

总结：
本文通过结合HOF@Au作为SERS基底和DNA酶介导的DNA步行者作为信号放大器，成功开发了一种用于检测食品中洛美沙星（LOM）的超灵敏SERS传感器。HOF@Au基底具有高比表面积和强吸附能力，能够负载大量Au NPs，显著增强了SERS信号。DNA步行者和CHA循环进一步放大了信号，多间隙核壳结构的SERS标签产生了更多“热点”，显著增强了局域电磁场。该传感器实现了对LOM的超低检测限（4.62×10⁻¹⁴ mol/L），展现了良好的选择性和稳定性，为食品中抗生素的检测提供了新的思路。

展望：
本文的积极影响在于提供了一种高灵敏度、高选择性的SERS检测方法，能够有效检测食品中的洛美沙星。未来的研究可以进一步优化HOF@Au基底的制备条件，提高其稳定性和重复性。此外，可以探索更多类型的抗生素检测，验证该方法的普适性。同时，结合便携式拉曼光谱仪，有望将该技术应用于现场快速检测，为食品安全监管提供有力工具。

Efficient SERS Substrate HOF@Au in Conjunction with DNAzyme-Mediated DNA Walker as a Signal Amplifier for the Ultrasensitive Detection of Lomefloxacin
文章作者：Runzi Zhang, Shunbi Xie,* Xiaoyu Yang, Yao Liu, and Yi He*
DOI：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c06713
文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.4c06713

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