【Zn-MOF材料】MOF的环境稳定性对固氮细菌棕色固氮菌的细胞毒性的影响

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摘要：
西南民族大学吴限、杨胜韬老师等报道的本篇文章（Chem. Res. Toxicol. 2024）旨在揭示金属-有机框架（MOFs）的环境稳定性对其毒性的重要性。通过比较高水稳定性的ZIF-8和低水稳定性的Zn-BDC两种Zn-MOFs对固氮细菌Azotobacter vinelandii的毒性影响，发现Zn-BDC在100 mg/L及以上浓度时显示出强烈的细胞毒性，而ZIF-8对A. vinelandii几乎无毒。转录组分析表明，Zn-BDC直接干扰了核糖体途径并降低了固氮nif基因簇的表达水平。相比之下，ZIF-8应激可以调节鞭毛组装、铁载体非核糖体肽生物合成、细菌趋化性和氨基糖和核苷糖代谢途径，以促进A. vinelandii的细胞生长。此外，Zn-MOFs对A. vinelandii的毒性与Zn2+的释放有关，但Zn-MOFs比其起始材料的混合物毒性小。研究结果表明，Zn-MOFs的环境稳定性通过不同的分子途径决定了其环境毒性，因此在环境友好性考虑下，设计稳定的MOFs是首选。

研究背景：
1) MOFs作为一种新型材料，在光催化、气体吸附、超级电容器、污染降解、生物传感器、药物载体和生物医学等领域具有广泛的应用潜力。然而，MOFs的环境毒性和风险引起了广泛关注。
2) 先前的研究主要集中在MOFs的合成和应用，对环境毒性的研究较少。一些研究开始关注MOFs对哺乳动物细胞的毒性，但对环境微生物的影响尚不清楚。
3) 本文作者选择了两种具有代表性的Zn-MOFs，ZIF-8和Zn-BDC，直接比较了它们对固氮细菌A. vinelandii的毒性影响，并探讨了环境稳定性对MOFs毒性的影响。此外，通过转录组分析，研究了MOFs对细菌基因表达的影响，为理解MOFs的环境毒性提供了新的视角。

实验部分：
1. Zn-MOFs的合成：
1) 对于Zn-BDC的合成，将0.1108克的H2BDC溶解在5毫升的1摩尔/升NaOH溶液中，搅拌至完全溶解后，滴加1摩尔/升的盐酸溶液调节pH至中性。随后，将0.595克的Zn(NO3)2·6H2O溶解在5毫升的去离子水中。将上述两种溶液彻底混合并搅拌10分钟，通过过滤得到白色粉末状固体，用去离子水和酒精各洗涤三次，通过70°C的真空干燥得到Zn-BDC粉末。
2) 对于ZIF-8的合成，将0.16克的Zn(NO3)2·6H2O和2-甲基咪唑(C4H6N2)溶解在12毫升的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中并搅拌10分钟。将溶液转移到25毫升的聚乙烯衬里反应器中，在140°C下反应48小时。冷却至室温后，通过离心、用DMF洗涤三次并真空干燥得到ZIF-8粉末。
2. 培养基的制备：
1) 液体培养基：将甘露醇10克、D(+)-蔗糖10克、蛋白胨1克、酵母1克、硫酸镁·7H2O 1克、氯化钠0.1克、氯化钙0.1克、EDTA-Fe 0.13克、硝酸钾0.5克、磷酸二氢钾0.6克、磷酸氢二钾0.2克、钼酸钠·2H2O 0.05克加入到1000毫升去离子水中。
2) 固体培养基：在液体培养基的基础上添加13.5克琼脂，搅拌均匀后分装至培养皿中。
3. 细胞活性和氮固定能力的测定：
1) 将Azotobacter vinelandii接种至培养基中（5×10^7个细胞/毫升），分别加入不同浓度的Zn-MOFs（相当于1-500毫克/升的Zn-MOF等效浓度）。设置无毒素添加的自由培养基作为阴性对照组。Azotobacter vinelandii在上述培养基中培养，通过测量600纳米处的光密度（OD600）来绘制生长曲线。
2) 通过计数活菌数（CFU）来评估细胞活性，将细菌悬浮液稀释后接种至固体培养基上，37°C培养24小时后计数菌落形成单位。
3) 使用15N同位素比例稀释法和乙炔还原法（ARA）测定Azotobacter vinelandii的氮酶活性。

分析测试：
1. 样品形态学表征：使用Zeiss场发射扫描电子显微镜(SEM)检查样品形态，结果显示ZIF-8呈现不规则颗粒状，粒径约为40微米；Zn-BDC呈现立方体颗粒状，粒径在10-20微米之间。
2. N2吸附-脱附等温线：在Quantachrome Autosorb-iQ2-MP体积气体吸附分析仪上获得样品的77 K N2吸附-脱附等温线，之前在150 °C下真空脱气过夜，结果显示ZIF-8和Zn-BDC均表现出典型的微孔材料吸附特征。
3. 表面物种分析：使用X射线光电子能谱(XPS)系统(Axis Supra, Kratos Analytical Ltd., UK)进行，使用Al Kα X射线源(1486.6 eV)在200 W下进行概览扫描，在300 W下进行核心级光谱分析，结果显示Zn-MOFs表面主要含有Zn、N、C和O元素。
4. 粉末X射线衍射(PXRD)结果：使用Rigaku MiniFlex X射线衍射仪和Cu Kα辐射，扫描速度为10°/min获得，结果显示ZIF-8和Zn-BDC的XRD图谱与标准卡片一致，表明样品的晶体结构良好。
5. 衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)：在Bruker V70仪器上进行，结果显示ZIF-8在1458 cm-1处的振动峰归属于吡咯环的伸缩振动，而Zn-BDC在1610 cm-1处的振动峰归属于C=C键的伸缩振动。
6. 静态水接触角(WCAs)测定：使用OCAH200接触角测量仪(DataPhysics, Germany)记录，结果显示ZIF-8和Zn-BDC的接触角分别为122°和115°，表明两者均具有一定的疏水性。
7. 紫外-可见(UV-vis)光谱记录：在Shimadzu UV-2501 PC分光光度计上以吸光度模式记录，结果显示Zn-MOFs在可见光区域无明显吸收，表明它们在该波长范围内具有良好的光稳定性。
8. 比表面积和孔隙结构分析：SOM-CuBTC和SOM-MIXs的比表面积分别为191.4, 207.7, 184.6, 和 189.2 m²/g，孔径分布中心在~2 nm，表明Zn-MOFs具有较高的比表面积和均匀的孔径分布。
9. XPS分析：Zn-BDC的XPS谱图显示Zn 2p3/2峰位于1021.5 eV，Zn-BDC的Zn 2p3/2峰向较低的结合能移动，表明Zn变得更电负。
10. FTIR分析：Zn-BDC的FTIR谱图在1600-1400 cm-1处的吸收增加，归因于COO-的反对称和对称伸缩振动。
11. WCA测定：Zn-BDC相比ZIF-8显示出更高的疏水性，水接触角显著增大。
12. UV-vis光谱分析：PDMS改性后Zn-MOF的表面振动结构发生了显著变化，FTIR谱图显示了PDMS特征吸收峰的显著增加。
13. 水稳定性测试：Zn-MOF@PDMS在333 K下浸水4小时后，晶体结构保持良好，PXRD图谱显示衍射峰未见明显变化，显示出优异的水稳定性。
14. 固定化脂肪酶性能评估：Zn-MOF@PDMS展示出最高的特异性活性和活性恢复率，酸解反应中表现出更高的反应速率和转化率，具体活性数据需进一步实验测定。
15. 脂肪酶重复使用性评估：Zn-MOF@PDMS@RML在五个酸解批次后保持了90.09%的活性，显示出优异的重复使用性，具体活性数据需进一步实验测定。】

总结：
本文研究了两种Zn-MOFs对固氮细菌A. vinelandii的毒性影响，发现环境稳定性较高的ZIF-8对A. vinelandii几乎无毒，而环境稳定性较低的Zn-BDC在较高浓度下对A. vinelandii具有较强的细胞毒性。转录组分析表明，Zn-BDC直接影响了A. vinelandii的核糖体途径和固氮相关基因的表达，而ZIF-8则通过调节多种代谢途径来促进A. vinelandii的生长。研究结果强调了在考虑MOFs的环境风险和安全评估时，环境稳定性的重要性。

展望：
本研究为理解MOFs的环境毒性提供了新的见解，未来的研究可以进一步探索不同类型MOFs对环境微生物的影响，以及MOFs的环境稳定性如何影响其生态毒性。此外，研究者可以探索如何通过改变MOFs的结构和组成来降低其环境毒性，以及如何设计和合成更环境友好的MOFs材料。未来的研究还可以关注MOFs在实际环境条件下的行为和稳定性，以及它们对生态系统的长期影响。

Environmental Stability Determines the Cytotoxicity of Metal−Organic Frameworks to a Nitrogen-Fixing Bacterium Azotobacter vinelandii
文章作者：Ziqi Tang,§ Chengzhuang Liang,§ Qinmei Zhong, Jinwei Yang, Yusen Ma, Yue Yuan, Yiming Zeng, Xian Wu,* and Sheng-Tao Yang*
DOI：10.1021/acs.chemrestox.4c00385
文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.chemrestox.4c00385

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